今天小編就帶大家來(lái)了解一下高效液相色譜儀。我將從原理、結(jié)構(gòu)及功能、色譜特點(diǎn)以及應(yīng)用等四個(gè)方面介紹一下高效液相色譜儀。
原理：高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。HPLC廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研究以及環(huán)境研究中。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入檢測(cè)系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的“吸附-解吸”的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式輸出檢測(cè)結(jié)果。
根據(jù)分離機(jī)制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法。
1.液固吸附色譜法
液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，根據(jù)各組分吸附能力差異而使組分得以分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數(shù)用于非離子型化合物。吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類(lèi)。對(duì)流動(dòng)相的要求為：
1)選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。
2)選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。
3)選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測(cè)器相匹配，如果使用紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用在檢測(cè)波長(zhǎng)下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測(cè)器，就不能用梯度洗脫。
4)選用的溶劑應(yīng)對(duì)樣品有足夠的溶解能力，以提高測(cè)定的靈敏度。
5)選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。
6)應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。
液固色譜法是以表面吸附性能力為依據(jù)的，所以它常用于分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團(tuán)，但數(shù)量不同的樣品。
2.液液分配色譜法：固定相為液體，根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法采用極性固定相，流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑，常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，流動(dòng)相為水或緩沖溶液，適用于分離非極性和極性較弱的化合物。其中，反相色譜應(yīng)用*。
3.離子交換色譜法：固定相是離子交換樹(shù)脂。樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
結(jié)構(gòu)及功能：HPLC儀一般由溶劑輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)(色譜柱)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理與記錄系統(tǒng)組成，具體包括儲(chǔ)液器、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀或數(shù)據(jù)工作站等幾部分。其中輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器是HPLC儀的關(guān)鍵部分。
1.溶劑輸送系統(tǒng)
儲(chǔ)液器：用來(lái)貯存數(shù)量足夠、符合要求的流動(dòng)相。配有溶劑過(guò)濾器，以防止流動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)。
脫氣器：脫氣的目的是為了防止流動(dòng)相從色譜柱內(nèi)流出時(shí)釋放出氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，從而引起噪聲，不能正常檢測(cè)。
輸液泵：將儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相連續(xù)不斷地以高壓形式進(jìn)入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過(guò)程。
梯度洗脫裝置：是在分離過(guò)程中通過(guò)逐漸改變流動(dòng)相的組成增加洗脫能力的一種裝置。
2.進(jìn)樣系統(tǒng)
進(jìn)樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進(jìn)樣方式可以分為兩種：閥進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣。比較常用的是采用自動(dòng)進(jìn)樣器裝樣。
3.分離系統(tǒng)色譜柱：對(duì)樣品進(jìn)行分離，是整個(gè)色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響到分離的效果。
4.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器：將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測(cè)量的電信號(hào)，被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收，得到樣品分離的色譜圖。
5.數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并參與HPLC儀器的自動(dòng)控制。
色譜特點(diǎn)
高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0mL/min。
高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。
靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
應(yīng)用
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類(lèi)繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。
HPLC成為解決生化分析問(wèn)題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類(lèi)，海水中的不揮發(fā)烴類(lèi)，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。
